Les endotoxines sont le contaminant principal dans les substances biologiquement actives. Les endotoxines, également appelées lipopolysaccharides (LPS), sont un composant de la membrane cellulaire des bactéries Gram-négatives. Une seule cellule d’E. Coli contient environ 2 millions de molécules LPS, qui sont libérées dans le lysat pendant la lyse cellulaire, comme cela se produit dans la production de la plupart des protéines recombinantes. De nombreuses autres bactéries fécale libèrent également des LPS, des gants contaminés, du matériel de laboratoire, des tampons et des produits en aval (milieux de culture cellulaire, solutions de substance purifiée ou de réactif).
La présence d’endotoxines dans les médicaments (applications pharmaceutiques), synthétiques comme les biosimilaires et recombinants, peut provoquer chez les organismes hôtes des réactions pyrogènes (fièvre), mais aussi des frissons, une hypotension, un syndrome de détresse respiratoire chez l’adulte, une coagulation intravasculaire disséminée et un choc toxique / endotoxique, lésion tissulaire, voire mortelle.
Le test de détection des endotoxines est l’un des tests de contrôle de qualité les plus critiques requis par la FDA pour tous les médicaments dans leur formulation finale. Par conséquent, il est essentiel d’éliminer les endotoxines des médicaments parentéraux humains et animaux, des produits biologiques et des dispositifs médicaux, de l’étape de R&D aux applications cliniques.
Cet article concerne en particulier les applications biotechnologiques, qui ont reçu moins d’attention que le domaine pharmaceutique ou principalement dans ce contexte.
1. Endotoxines en biotechnologie
Il est donc essentiel de vérifier l’absence des endotoxines et de les retirer de tous les échantillons ou réactifs qui sont utilisés, ou seront utilisés en aval, avec des cellules vivantes, quelles que soient les procédures de stérilisation finale et / ou les pratiques aseptiques (les problèmes d’endotoxines ne sont que réduits). Ceci s’applique dans de nombreux domaines: pharmaceutique, cosmétique, voire agro / alimentaire / boissons, biomédical et diagnostic de santé (mauvaise interprétation des résultats).
Conseils sur les endotoxines dans les industries biotechnologiquesLes implants biomédicaux, et en particulier les produits destinés au contact avec le liquide céphalo-rachidien, sont soumis aux restrictions les plus sévères, étant tenus de respecter les normes les plus strictes de la FDA américaine pour les endotoxines bactériennes. |
Les risques d’endotoxines concernent de nombreux types d’échantillons et de réactifs pour les applications sensibles aux endotoxines, et à chaque étape en amont:
- Techniques in vitro telles que l’ingénierie cellulaire, la transfection de cellules en amont de la culture cellulaire;
- Dans les milieux de culture de cultures cellulaires, notamment pour la production de polypeptides / protéines ou gènes recombinants;
- Dans les échantillons purifiés (c’est-à-dire des tampons et des fractions en chromatographie);
- Avant l’administration dans les tissus / corps animaux (expérimentations ex-vivo et animales);
- Dans les échantillons pour les dosages cellulaires sensibles aux endotoxines et les dosages cellulaires, mais aussi pour la transfection.
2. Élimination des endotoxines
L’élimination des endotoxines a été réalisée à l’aide de nombreuses techniques
- Systèmes d’extraction par solvant organique-eau;
- Système aqueux en deux phases;
- Ultrafiltration (basée sur la taille);
- Chromatographie d’exclusion de taille (peut être combinée dans certains cas à l’étape de purification et d’élimination des endotoxines (PM de composés loin des LPS);
- Elimination par affinité à la polymyxine B ;
- Elimination par affinité à la polylysine ;
- Chromatographie par échange d’ions (DEAE sepharose);
- D’autres moyens peuvent éliminer les endotoxines dans des applications particulières (ne convenant pas à de nombreux procédés), telles que l’électrophorèse, les détergents, l’ultracentrifugation ou la digestion enzymatique de protéines.
Chaque méthode présente des limites: pour la plupart, les performances dépendent du type d’échantillon / composé à nettoyer, de par sa charge ionique et sa taille, mais aussi de sa stabilité et son activité biologique. Certaines sont applicables à petite ou grande échelle, certaines sont rapides, certaines sont très exigeantes en main-d’œuvre, en amont et en aval. Par exemple, la chromatographie SEC peut combiner dans certains cas l’étape de purification et l’élimination de l’endotoxine (PM de composés loin des LPS) tout en étant compatible avec les dosages en aval; la poly-lysine a éliminé les problèmes de toxicité associés à l’utilisation de ligands de polymixine B de faible qualité et de tampons de désoxycholate de sodium.
Conseil technique – Élimination des endotoxinesLes méthodes d’essai et de vérification par étape suivantes peuvent être proposées:
|
3. Système d’élimination des endotoxines des ADN
Pour l’élimination rapide des endotoxines de l’ADN préalablement purifié.
Les endotoxines réduisent considérablement l’efficacité de la transfection dans les lignées cellulaires sensibles aux endotoxines. Par conséquent, l’élimination des endotoxines des préparations plasmidiques est souvent nécessaire avant l’utilisation de l’ADN dans de telles applications en aval.
Principales caractéristiques
- Purifier l’ADN avec des niveaux d’endotoxines inférieurs ou égaux à 0,1UE/µg d’ADN
- Élimine les endotoxines des échantillons d’ADN variés
- ADN sans endotoxine avec un taux de récupération> 90%
- L’ADN obtenu est prêt pour les transfections ou d’autres applications sensibles aux endotoxines
Les kits d’élimination des endotoxines de Norgen réduisent efficacement les endotoxines à 0,1UE ou moins, fournissant un ADN plasmidique immédiatement prêt pour les transfections ou d’autres applications sensibles aux endotoxines. La résine exclusive de Norgen fixe l’ADN tandis que les endotoxines, les sels et autres contaminants sont éliminés. Le format pratique avec une colonne de centrifugation peut être utilisé en environ 30 minutes avec une récupération typique de l’ADN est >90% de l’échantillon de départ.
| Désignation |
Référence | Quantité | Datasheet |
| Endotoxin Removal Kit (Mini) – For DNA | 22700 | 25 preps |  |
| Endotoxin Removal Kit (Midi) – For DNA | 52200 | 10 preps | |
| Endotoxin Removal Kit (Maxi) – For DNA | 21900 | 4 preps | |
Des protéines, peptides et anticorps
 |
Les endotoxines peuvent déclencher une forte réponse immunitaire chez les hôtes mammifères, entraînant un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) et / ou une septicémie. Les endotoxines sont souvent difficiles à éliminer de la solution en raison de la grande variabilité de leurs poids moléculaires. De plus, les endotoxines sont relativement stables et insensibles aux changements de température et de pH.
Les ligands ayant une affinité pour les endotoxines peuvent être couplés à un système d’échange d’anions pour augmenter la force de liaison des endotoxines. Le système d’élimination des endotoxines ToxinEraser est basé sur une matrice d’affinité de polymyxine B modifiée (PMB), avec une capacité de fixation élevée (> 2000000UE/mL). Il permet une élimination efficace des endotoxines d’échantillons tels que des protéines, des peptides et des anticorps. Le niveau final d’endotoxines peut être réduit à un niveau aussi bas que 0,1UE/mL* avec l’utilisation répétée de la résine d’élimination des endotoxines ToxinEraser. |
*L’efficacité d’élimination finale peut varier en fonction du type / de la source d’échantillon.
Principales caractéristiques
- Capacité de fixation élevée d’au moins 2 000 000EU/mL (CV)
- Rendement de récupération élevé: >90% avec une perte d’échantillon minimisée
- Haute stabilité et efficacité d’élimination élevée
| Désignation | Référence | Quantité | Datasheet |
| ToxinEraserTM Endotoxin Removal Kit | L00338 | 1 Kit | |
Détection des endotoxines
Le ToxinSensor Endotoxin Detection System utilise des méthodes de test LAL (Limulus Amebocyte Lysate) approuvées par la FDA pour réaliser un test d’endotoxine rapide et très sensible. Le Chromogenic LAL Endotoxin Assay kit peut détecter quantitativement l’endotoxine dans une large plage (0,005-1UE/mL). Le Gel Clot Endotoxin Assay kit est un test qualitatif rapide montrant un résultat positif ou négatif.
ToxinSensor Endotoxin Detection System
Pour garantir des résultats précis avec une méthode de dosage rapide des endotoxines !
- Réactifs prêts-à-l’emploi
- Linéarité et reproductibilité élevées
- Haute sensibilité garantie: 0,005EU/mL
Les ToxinSensor Endotoxin Assay Kits peuvent être largement utilisés dans les tests d’endotoxines de produits finis in vitro, y compris ceux pour les médicaments parentéraux humains et animaux, les produits biologiques et les dispositifs médicaux.
Chromogenic LAL Assay
Le kit utilise un lysat d’amébocyte Limulus modifié et un substrat de production de couleur synthétique pour détecter quantitativement l’endotoxine chromogéniquement dans une large gamme (0.005-1EU/mL).
| Désignation | Référence | Quantité | Datasheet |
| ToxinSensor™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | L00350 | 1 Kit (32 rxns) | |
| ToxinSensor™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | L00350C | 1 Kit (16 rxns) | |
Chromogenic LAL Assay
Le kit utilise un lysat d’amébocyte Limulus modifié et un substrat de production de couleur synthétique pour détecter quantitativement l’endotoxine chromogéniquement dans une large gamme (0.005-1EU/mL).
| Désignation | Référence | Quantité | Datasheet |
| ToxinSensor™ Gel Clot Endotoxin Assay Kit | L00351 | 1 Kit | |
ToxinSensor Single Test Kit
Le kit est conçu pour être un test d’endotoxine in vitro qualitatif pour les médicaments parentéraux humains et animaux, les produits biologiques et les dispositifs médicaux.
Le lysat d’amébocyte de Limulus (LAL) doit être reconstitué avec l’échantillon ou le contrôle directement. Il n’est pas nécessaire de reconstituer le système avec le LAL Reagent Water avant utilisation. Après 1 heure d’incubation et en présence d’endotoxine, une gélification se produit; en l’absence d’endotoxine, la gélification ne se produit pas.
Une série de kits de test simples ToxinSensor™ est fournie avec des sensibilités différentes (0.015EU/mL, 0.03EU/mL, 0.06EU/mL, 0.125EU/mL and 0.25EU/mL).
Lorsque vous utilisez le kit de test unique ToxinSensor™, il vous suffit d’ajouter 200µL d’échantillon ou de contrôle au LAL, puis d’attendre le temps d’incubation requis pour permettre au gel de se former.
| Désignation | Référence | Quantité | Datasheet |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00448-40 | 1 kit (40 assay) 0.03EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00448-20 | 1 kit (20 assay) 0.03EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00449-20 | 1 kit (20 assay) 0.06EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00449-40 | 1 kit (40 assay) 0.06EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00450-20 | 1 kit (20 assay) 0.125EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00450-40 | 1 kit (40 assay) 0.125EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00451-20 | 1 kit (20 assay) 0.25EU/mL | |
| ToxinSensor™ Single Test Kit | L00451-40 | 1 kit (40 assay) 0.25EU/mL | |
Produits accessoires
| Désignation | Référence | Quantité | Datasheet |
| ToxinEraser™ Endotoxin Removal Resin | L00402 | 1mL | |
| ToxinSensor™ Endotoxin-free Tubes | M01072-10 | 10 Tubes | – – – |
| ToxinSensor™ Endotoxin-free Pipette Tips (1mL, Blue) | M01063 | 1PK of 6 tips | – – – |
| ToxinEraser™ Regeneration Buffer | M01053 | 125mL | – – – |
| ToxinEraser™ Equilibration Buffer | M01054 | 125mL | – – – |
Réactifs sans endotoxines
Recherchez nos réactifs sans endotoxines.
- Bovine Albumin, Low endotoxin, 30% solution #C71151
- Bovine Serum Albumin, Low endotoxin # C71141
- Bovine Serum Albumin, VERY LOW Endotoxin #C7114A
Consultez la fiche technique en ligne.
En savoir plus :
- N’hésitez pas à interroger nos chefs de produit à : interbiotech@interchim.com
